一、实验原理：

通过血管发生或血管发生形成新血管对于正常伤口愈合是关键的，内皮细胞保留了分裂和快速迁移的能力，可响应血管生成信号，基质胶可以很好的模拟机体环境，使得内皮细胞在体外可以进行成管实验

二、所用实验材料：

细胞：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）

基质胶：碧云天Matrix-Gel基质胶(标准型，不含酚红)

载玻片：ibidi血管生成载玻片（15孔）

三、个人实验相关：

1.选用HUVEC细胞（推荐3-5代），使其在24小时内达到80%左右融合。然后对其进行饥饿处理：将完全培养液换成含0.2% FBS的DMEM培养液，培养24小时。

2.解冻基质胶以及预冷耗材，从−20℃或−80℃冰箱中取出基质胶，置于冰上，放入4℃的冰箱过夜解冻，同时预冷10ul、200ul枪头各一盒

3.操作前，打一盒冰，使用预冷的移液管或枪头混合基质胶至均匀状态，将完全解冻的基质胶放至在冰上，翻转几次以混合内容物，用DMEM1：1稀释，后每孔加入10ul（建议冰上操作）

4.将孔板转移到培养箱中孵育30min-1h，使基底膜形成凝胶。

5.孵育过程中，配制相应药液，对T25瓶中达到80%融合的细胞进行消化，离心，计数。

7.用对应药液重悬细胞，使浓度为20w个每毫升

8.孔板中每孔加入含待测样本的50μL细胞悬液（含1w个细胞，载玻片说明书推荐密度）

9.将孔板置于37℃，5%CO2，90%湿度条件的培养箱培养，并在0,2,4,6,8h时间点拍照观察（具体成管时间可以设置一个预实验摸一下看看），一般3-12小时可见血管网络形成，成管时间与细胞状态密切相关。

四、图片处理：

用Image J的Angiogenesis Analyzer插件分析即可

五、小tips：

1.加基质胶的时候一定要慢，可以垂直或稍倾斜加，而且尽量不要把枪头里的基质胶全打完，不然容易产生气泡

2.拍摄出来的图片不要有暗角，尽量拍亮点，方便后续image J的图片分析

3.用同款载玻片上机拍照时，可能会遇到孔底有划痕的情况，之前问了厂家，说底部有个膜可以撕，但是说明书上没写，很难撕，如果撕的话建议种板前撕下来，然后放培养箱时可以将这个载玻片放置在大培养皿里

文章出自：实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/